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本文作者 崔慧斐 （O）- e-mail:cuihuifei sdu.edu.cn女，教授，硕士生导师，主要从事生化药学研究。 山东大学药学院生化与生物技术药物研究所，国家糖工程技术研究中心，国家药品监督管理局糖药物质量研究与评价重点实验室。 前文·回顾 ◆百岁肝素：不老的传奇（上篇） ◆百岁肝素：不老的传奇（中篇） 百岁肝素：不老的传奇（下篇） PART05 5.肝素深度研发：创新持续进行时 （1）新来源 1）牛来源：牛来源肝素实际上是最早上市的肝素，年第一个获得FDA批准的肝素即为牛肺肝素。此后，牛肠黏膜肝素也上市，并一直在欧美使用。直到20世纪90年代，由于欧洲疯牛病的爆发，担心牛来源肝素会污染此病毒，牛来源肝素逐渐从欧美市场消失。实际上美国药典肝素钠专论中并没有将反刍哺乳动物列在许可的肝素钠来源之外，标签上是要求标注肝素的动物种属来源；但年FDA颁布的《肝素粗品质量监控工业指南》中规定粗品肝素来源于猪，不能混有反刍动物来源的肝素。 肝素作为基本药物，全球主要的供应地为中国，猪为唯一动物来源，故美国FDA认为肝素存在资源短缺的风险。为此，年开始，FDA启动牛肝素重回美国市场的工作,建立牛肝素钠USP专论的相关研究工作已基本完成。实际上，在巴西、阿根廷、印度等国家，牛肝素一直在应用，未见因使用牛肝素感染疯牛病的报道。巴西分别于和年率先建立了猪肝素和牛肝素巴西药典专论，为希望引入牛肝素的国家提供了重要借鉴。 需要说明的是，牛肝素与猪肝素的结构有明显的差异（前者有更高的N-硫酸化程度），牛肝素的抗凝活性约为U/mg,远低于猪肝素(通常可以达到U/mg以上)。因此，它们二者被视为是具有抗凝和抗栓药理作用的不同品种！而且，牛肝素引起HIT(肝素诱导的血小板减少症，最凶险的肝素不良反应)的发生率高于猪肝素。 2）化学/酶法合成：肝素在哺乳动物肥大细胞中合成和贮存。现在已阐明肝素生物合成的全过程，共6步反应，均需要酶作为催化剂。目前，所有这些酶均可通过基因工程技术获得。化学/酶法合成肝素寡糖总体来说就是模仿肝素生物合成路径，逐步合成肝素寡糖骨架。然后，用化学手段和酶学手段对该寡糖骨架进行修饰，主要就是硫酸化修饰，硫酸基是肝素主要的官能团。目前，用这种方式已经合成了肝素七糖、十二糖和二十一糖。与化学全合成相比，化学/酶法合成肝素寡糖步骤少、收率高，比如肝素七糖的合成共十步反应，总收率43%，其活性与磺达肝癸钠相当，但后者化学全合成的步骤为50余步，收率不足0.1%。用这个方式合成的肝素寡糖还处于实验室研究阶段，还需要解决不少问题才能走向产业化。化学/酶法合成能合成有临床应用潜能的、结构和性质确定的肝素寡糖，这点是当前各种LMWH不能比拟的；而且，化学/酶法合成肝素寡糖也没有病毒污染的风险。再者，化学/酶法合成肝素寡糖可以全过程进行GMP管理，避免出现8年肝素污染类似事件的发生。如果它最终实现产业化，那么就实现了多年来行业中的一个愿望，那就是“GettingtheFarmOutofPharmaforHeparinProduction”。 3）生物工程肝素：与多肽和蛋白质不同，多糖的合成没有模板，是一系列酶促反应的产物。生物工程肝素的制备需要将肝素生物合成酶的某几个基因导入到如肥大细胞瘤细胞，构建工程细胞，然后表达有抗凝活性的肝素。还有一个途径是用细菌的荚膜多糖作为肝素起始多糖骨架，然后，用化学和酶学方法进行修饰，获得有抗凝活性的多糖，其结构有别于天然肝素。还有一种尝试是把人肥大细胞与人胚肺成纤维细胞共培养，以维持人肥大细胞合成肝素的能力。最新研究发现了一个肝素/硫酸乙酰肝素合成酶HS3ST1和HS3ST3A1（这两个酶催化ATIII结合位点的合成）的转录抑制因子ZNF，ZNF在肝素合成细胞—肥大细胞中水平很低。这对今后构建工程细胞生产有抗凝活性的肝素具有重要的意义。 （2）新应用 肝素类药物除了作为不可替代的一线抗凝和抗血栓药物，还有很多新应用在持续探讨中。肝素为什么可以如此多能呢？这是因为肝素与硫酸乙酰肝素类似，后者广泛分布在各类细胞表面和胞外基质中，可以与体内种蛋白质相互作用！我们知道，蛋白质是生命活动的执行者，因而硫酸乙酰肝素通过调控这些功能蛋白质分子，包括酶、细胞因子、生长因子等，在生物体的发育与体内稳态在发挥至关重要的作用。肝素作为硫酸乙酰肝素的结构类似物，已经发现可以与众多生理和病理过程中发挥重要作用的百余种蛋白质结合，这些都是新药研发的机会。所以，肝素是宝藏分子！当前我们只利用了肝素对凝血过程的影响，使其成为不可替代的一线抗凝药物。目前研究较充分的抗凝以外的新应用主要包括抗肿瘤、抗炎、抗病毒（如新冠病毒）等。 1）抗肿瘤：晚期肿瘤患者往往存在血液高凝，需要进行抗凝治疗。结果惊奇地发现使用肝素或低分子肝素进行抗凝治疗的肿瘤患者，生存期明显延长！现在明确肝素通过多个途径发挥抗肿瘤作用。首先，肝素能通过抑制肿瘤血管生成起到类似“饿死”肿瘤或抑制肿瘤生长的作用；第二，肝素可以抑制肿瘤转移，这是因为肝素可以抑制肿瘤转移过程中的关键酶—乙酰肝素酶，这个酶负责为肿瘤转移“开辟道路”。有一个肝素衍生物Necuparanib(M),曾被FDA批准为治疗胰腺癌的孤儿药，已完成对胰腺癌临床Ⅰ/Ⅱ期研究。另一个肝素衍生物Roneparstat(SST)也已获得FDA的临床研究许可，用于治疗多发性骨髓瘤，现已完成了Ⅰ期临床试验。这两个肝素衍生物都没有抗凝活性，因此，在抗肿瘤应用中将没有出血风险。 2）抗病毒：病毒感染机体的第一步是粘附在宿主的靶细胞上。这个过程中细胞表面的硫酸乙酰肝素往往作为共受体参与病毒粘附。此时，给予肝素或LMWH，它们便可作为天然的诱饵受体，干扰病毒与靶细胞的上述粘附过程，从而抑制病毒感染。现在已经充分证实：肝素或LMWH对于新冠病毒的感染过程有显著的抑制作用！肝素显示出成为广谱抗病毒药物的潜能。而且，对于病毒严重感染引发的炎症风暴、血栓（二者是新冠患者的主要死因），肝素同时具有有益的治疗作用。这已在一年多的全球范围内新冠肺炎救治中得到广泛的应用和普遍认可。 3）抗炎：临床实践发现，肝素/LMWH对包括胰腺炎、哮喘、肺炎、脓毒症等均有效，其抗炎作用的靶点包括补体蛋白、选择素、乙酰肝素酶、趋化因子等。 4）抗疟疾：疟疾仍是严重威胁人类生命的流行病之一。肝素对疟原虫感染的红细胞表现出特异性的结合能力，并抑制其对微血管的粘附过程。肝素衍生物Sevuparin是一种通过化学解聚肝素获得的LMWH，无抗凝活性，但Sevuparin保留了肝素对疟原虫感染的红细胞的上述作用，它或将成为治疗严重恶性疟原虫的一种新的候选药物。 （3）新的给药方式 一直以来，肝素主要采用静脉给药。当前，以依诺肝素为代表的多种LMWH已替代了肝素大部分的临床应用，其给药方式主要为皮下注射给药。对肝素非注射给药方式的研究多年来持续进行中。 1）口服给药：肝素直接口服给药的生物利用度非常低，但这种给药方式方便，顺应性好，因此，多年来人们一直致力于该给药方式的研究，遗憾的是至今尚未取得成功。 已有的探讨主要包括使用吸收促进剂、制备肝素缀合物。一种辛酸钠的氨基衍生物—SNAC用作吸收促进剂，制备的肝素/SNAC口服溶液曾开展了三期临床试验，用于预防接受髋关节置换手术患者静脉血栓形成，有效性良好，但其味道令患者难以接受，顺应性差，导致该制剂至今尚未上市。还有研究人员将LMWH与脱氧胆酸乙胺制成缀合物，用于促进口服LMWH在肠道内的吸收，有增强其口服生物利用度的作用。近些年来也尝试采用微胶囊、纳米颗粒以及纳米乳液等新剂型，用以增强肝素在胃肠道中的稳定性并且降低肠道菌群对其的降解作用。但也存在一些需要解决的难题，如药物的吸收延迟;聚合物材料也可能导致肠道内毒素和潜在的毒性化合物的吸收。 2）吸入给药：吸入给药是利用雾化装置使药液形成细小雾滴，通过口或鼻吸入，进入呼吸道，从而达到预防和治疗疾病的目的。吸入给药不仅可以作用于局部，还可快速作用于全身。肝素吸入给药可作用于全部肺泡，非常适合肺部疾病的治疗，且很少会引起诸如出血等不良反应。吸入雾化肝素可改善重度慢性阻塞性肺病（COPD）患者的肺功能;吸入肝素也用于囊性纤维化、肺纤维化、急性呼吸窘迫综合征、过敏性鼻炎、哮喘和支气管收缩等方面的临床试验。肝素吸入用于新冠肺炎的治疗正进行2项国际多中心随机对照临床试验（RCTACTRN:12600517976和RCTEudraCT:--95）。 3）透皮给药：透皮给药是一种既可作用于局部又可作用于全身的给药方式，用于后者时需透过皮肤角质层及皮肤附属器，这种给药方式不但方便简单而且可以增强药物的递送能力。肝素由于其相对分子质量大及所带电荷密度的原因很难透过角质层，因此需要一些外加辅助手段促渗透，如透皮微针技术、超声促渗透疗法、离子电渗疗法、透皮电穿孔法、微针与离子电渗疗法相结合。采用微针和离子电渗疗法相结合的策略，LMWH的渗透率比单独使用离子疗法高14.7倍，LMWH的渗透率比单独使用微针高5倍，LMWH的渗透率比单独使用超声促渗疗法高16倍等，而且安全性高，患者对此也表现出更高的顺应性，是很有前景的一种能应用于临床的透皮给药方式。 PART06 6.我国肝素产业在全球中的地位 自20世纪90年代以来，我国成为全球肝素原料药的主要供应国，产量占全球总量的一半以上，这主要得益于我国巨大的生猪养殖规模优势。但纵观百年来肝素类药物的发现与发展，从肝素到低分子肝素，再到磺达肝癸钠以及正在快速进展的化学/酶法肝素寡糖，创新和引领都是由欧美国家主导，它们始终以技术和标准统领全球肝素产业；我国以资源优势在肝素产业的中低端，即粗品和原料药换取相对微薄的收益和回报。近几年有所改观，我国生产的仿制（或生物仿制）依诺肝素钠制剂获准进入欧美法规市场。 PART07 7.总结 肝素从发现至今已逾百年，作为抗凝和抗血栓药物的临床应用已超过80年，历经了从肝素到低分子肝素，再到磺达肝癸钠的发展，化学/酶法合成肝素寡糖和生物工程肝素或许在不远将来成为肝素类药物的新来源。当前有不少口服抗凝药（NOACS），如沙班类(FXa抑制剂)、加群类（FIIa抑制剂）等闪亮登场，有人疑问：WillHeparinssurviveintheeraoftheNOACS?答案是：肝素类药物因具有快速起效且拥有拮抗剂的优势，其一线抗凝和抗血栓药物的地位不可撼动：NotonlysurvivebutmayoutservivetheNOACS！再者，肝素作为宝藏分子，还有抗凝和抗血栓以外的其他很多成为“新经典”的机会，百岁肝素的不老传奇仍将继续！最后，由衷希望肝素的下一个惊喜由我们中国带给世界！ 参考文献 上下滑动阅览 WardropD,KeelingD.Thestoryofthediscoveryofheparinandwarfarin.BrJHaematol,8;:?. McLeanJ.Thediscoveryofheparin.Circulation,;19:75?78. JaquesLB.Addendum:thediscoveryofheparin.SeminarsinThrombosisandHemostasis,;4:-. MarcumJA.Theoriginofthedisputeoverthediscoveryofheparin.JournaloftheHistoryofMedicineandAlliedSciences,0;55:37-66. HomanJDH.Asimplemethodforthepurificationofheparin.BiochBiophysActa,;2:?. MarksJ,TruscottBM,Withy
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