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白癜风精细诊疗 http://m.39.net/news/a_5778510.html 这篇文章还是很有借鉴价值的。以下是文章的思路和大概内容。 我们在免疫缺陷的NOD/SCID/γ-/-（NSG）小鼠的NALM-6肿瘤模型中测试了FMC63和CATCAR。 FMC63CART细胞减慢但不能阻止肿瘤生长，相比之下，相当数量的CATCART细胞导致肿瘤消退。在T细胞注射后第12天，两组小鼠的肿瘤负荷存在明显差异。 在BM（图2d）和血液（图2e）中，CATCART细胞的绝对数量明显大于FMC63CART细胞。CAR+T细胞上的衰竭标记淋巴细胞活化基因3（LAG-3），程序性死亡1（PD-1）和T细胞免疫球蛋白以及含黏蛋白结构域3（TIM-3）的表达水平相似CAT和FMC63CART细胞之间的连接。在CAT转导的T细胞中，TNF-α的表达更高，与我们的体外研究结果一致（图2f）。在所治疗的小鼠中，来自BM和血液的CART细胞显示出较高水平的CD（IL7-Rα）和B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）的表达（图2g，h和扩展数据图3d，e）。 这些结果表明，相对于高亲和力的CART细胞，低亲和力的CART细胞介导增强的抗肿瘤应答和扩增。 CATCART细胞的抗白血病功效和反应持续时间。 a，通过qPCR评估的白血病特异性IgH基因重排的MRD阴性CR率汇总表，以及进行性疾病，复发和复发性质的患者人数。 b，柱状图显示输注了CATCART细胞的个体患者的反应，反应持续时间以及复发和死亡的性质。 c，14位输注CATCART细胞的患者的OS的Kaplan–Meier图。 d，接受输液的14例患者的EFS的Kaplan-Meier图。感兴趣的事件定义为在维持至少28d（n=2）之前无反应或复发，或CR伴有或不伴有不完全血液学恢复的形态学复发，以先发生者为准。 e，6个月和12个月生存率的列表结果。 f，CART细胞的持久性与B细胞发育不全的持续时间相关，如柱状图所示。 在异种移植NALM-6模型中，CATCART细胞表达的活化和衰竭标记（TIM3，LAG3，PD-1）水平与FMC63CART细胞相似，但更大比例的肿瘤部位表达CD和Bcl-2。亚致死辐射后24小时和T细胞注射前7天，给小鼠注射1×GFP+F-luc+NALM-6细胞。在第1天评估了疾病植入。队列被随机分组，并且在注射CART细胞或未转导的T细胞作为阴性对照之前，将具有相似肿瘤负担的受体均匀分布在各组中。 a，使用IVIS成像系统评估肿瘤的生长。b，与FMC63（n=8）相比，接受CATCAR转导的T细胞（n=9）的队列中血液NALM-6细胞绝对数量减少。数据为平均值±标准差。P=0.；双面STUDENTt检验。c，门控CAR+细胞后，活化和衰竭标记LAG-3，TIM-3和PD-1的中值荧光强度（MFI）没有显着差异。数据为平均值±标准差n=9。d，门控CAR+T细胞后，通过流式细胞仪确定BM中CD阳性细胞的比例。数据为平均值±标准差。n=9；***P=0.，双向studentt检验。e，Bcl-2阳性细胞在BM中的比例。数据为平均值±标准差。n=5（FMC63CAR）;n=9（CATCAR）；***P=0.，双向STUDENTt检验。重复实验两次，结果相似。 我们设计了使用CATCAR对25岁以下高风险CD19+ALL（CARPALL）的患者进行的临床研究。资格标准在补充表1和研究方案（补充附录）中概述。招募了17位患者，其中14位接受了CART细胞输注（扩展数据图4）。随访患者的数据截止日期为年12月19日，中位随访时间为14.4个月。中位年龄为9岁，所有患者均患有晚期ALL，中位为4行既往治疗（补充表2）。异基因干细胞移植（SCT）后14例患者中有10例复发。所有患者均患有晚期疾病（补充表2和3）。淋巴切除术前，有4例患者形态学复发（胚细胞比例为17-81％），其中6例具有最低残留疾病（MRD）水平，而BM则为MRD阴性。MRD阴性的患者在全身照射（TBI）条件下的SCT（n=3）或颅骨照射（n=1）后出现孤立的中枢神经系统（CNS）复发，因此无法通过标准疗法成功治疗。 图4 CART细胞扩增并在外周血中持续存在。通过外周血的流式细胞术以及qPCR在第0、2、7、14和28天，每月最多6个月，每6周至1年，然后每6周一次的转基因特异性序列评估CART细胞的扩增输注后3个月至2年。a，代表性患者（CPL-14）外周血中CART细胞的流式细胞仪图（在可行的CD45+CD3+淋巴细胞上预选门）。通过用抗CATCAR的抗独特型抗体染色来检测CAR表达（y轴）。右上象限中的数字给出了表达CAR的T细胞的百分比。数据代表了在多个时间点取自n=13的患者的独立样本。b，在所有可评估的时间点，在13/14例输注患者中，外周血T细胞室内的CART细胞百分比。c，通过13/14名可评估患者的外周血流式细胞术检测到的CART细胞的绝对数量。d，通过转基因特异性qPCR评估，CART细胞在外周血中的扩增和持久性。 扩展数据图4CARPALL研究中患者的筛查，入组，治疗和随访。通过CARPALL研究的患者进展。已注册17位患者并符合研究条件。有可能在14位接受了淋巴结清扫和输注CART细胞的患者中产生了CART。在第一个月内有两名患者没有反应，一名死亡，一名退出研究。其余12例患者可以随访。我们能够在14/17患者（82％）中产生产品。14名患者中有12名接受了每公斤体重个细胞的目标剂量，而2名接受了每公斤体重0.73-0.78×个细胞的目标剂量（扩展数据图5b）。CART细胞主要表现为中枢记忆或幼稚干细胞记忆表型，PD-1和TIM-3双重表达水平较低（扩展数据图5a）。所有患者均接受氟达拉滨和/或环磷酰胺淋巴结清扫术。扩展数据图5 CART细胞产物表型和剂量。通过流式细胞术评估产生的CART细胞产物的CART细胞表达，以及存活的CD3，CD4和CD8细胞的百分比。*此外，对存活的CAR+CD45+CD3+淋巴细胞进行了CD45RA和CCR7染色，以确定不同T记忆亚群中CART细胞的比例（CD45RA+CCR7+记忆/幼稚T细胞；CD45RA-CCR7+中央记忆T；CD45RA+CCR7-效应T子记忆，表示RA）。最后，对存活的CAR+CD45+CD3+淋巴细胞进行染色，以检测其激活和耗尽标志物PD-1和TIM-3，并评估表达这两种标志物的CART细胞的比例。N=14种产品，但耗竭标记分析除外，其中n=13种可评估产品。线代表中值。冷冻保存的目标细胞剂量为1.2×CART细胞/kg，输注剂量为/kg，占解冻过程中细胞损失的20％。14例患者中有13例（93％）在CART细胞输注中位数7d（范围1-11d）后发生了CRS（根据Lee等人的标准14评估；扩展数据图6）。CRS一般较轻（1级，n=9；2级，n=4），持续5d。没有发生3级或4级CRS，也没有患者需要接受cilizumab治疗或接受重症监护。使用宾夕法尼亚大学的量表，我们确定3名患者由于低血压而需要输注大剂量/氧气的需求40％（补充表3），因此具有3级CRS。与缺乏严重CRS并与FMC63CART细胞的报道数据相反，我们发现促炎性细胞因子干扰素γ（IFN-γ）和白介素6（IL-6）以及IL-如图10所示，在少数患者的血液中，大多数患者的这些细胞因子没有升高（扩展数据图7a）。任何患者中IL-2，IL-4和TNF-α水平均未升高。除了合并感染的患者外，C反应蛋白（CRP）的水平通常较低。使用更敏感的30重细胞因子面板进行回顾性交叉验证，我们证明了在CRS表现更为显着的患者中，IFN-γ，IL-6，IL-8和可溶性IL-2受体的水平适度增加（例如，患者CPL-01，-02和-05）。扩展数据图6 不良事件。不良反应发生的频率以毒性分级和类型表示，在注入CART细胞后。Cytopenias被定义为嗜中性粒细胞或血小板减少，因为B淋巴细胞耗竭是CART细胞疗法的预期结果。B细胞发育不良定义为CART细胞输注后每μl血液中5B细胞。低丙种球蛋白血症定义为每L血液3gIgG。神经方面的副作用通常较轻。六名患者经历了不良事件的通用术语标准（CTCAE）1-2级神经毒性（扩展数据图6和补充表3和6），包括构音障碍，感觉异常和嗜睡。CART细胞输注后第37天，有1名患者（CPL-12）发生了4级脑病。与CAR相关的神经毒性相比，氟达拉滨与氟达拉滨更符合白细胞脑病的发生时间，不存在显着的先前CRS以及磁共振图像上存在白质变化。由于该人群的大量预处理和淋巴切除术，所以通常会发生Cytopenias（扩展数据图6和补充表6）。持续超过28d的Cytopenias和在没有复发的情况下初始计数恢复后出现新的血细胞减少症的情况被单独分析，因为这些可能与CART细胞疗法有关。十名患者的3-4级血细胞减少症（尤其是中性粒细胞减少症）持续至第28天后或在该时间点后复发。其中6例患有3-4级中性粒细胞减少症（42.9％；95％置信区间（CI），17.7-71.1％）和3例患者（21.4％;95％CI，4.7–50.8％）具有3-4级血小板减少症持续至第28天以后。一名患有中性粒细胞减少症，多发感染以及4级脑病的患者因败血症缓解而死亡。还有3个其他3–4级感染与长期中性粒细胞减少有关。CD19CART细胞持续存在的相关因素是B细胞发育不全，发生在13/14患者中。B细胞发育不良的中位持续时间为7.6个月，在最后一次随访中有12/14例患者出现B细胞发育不良（图3f和ExtendedData图6）。11例患者出现了低球蛋白血症（IgG3gL–1），其中6例需要更换免疫球蛋白。输注后30d，通过PCR对白血病特异性IgH基因重排进行评估，有10/13名可评估患者（77％）处于分子完全缓解（CR）或持续性CR（图3）。两名患者病情稳定，随后发展为CD19+疾病，其中一名患者获得的DNA量不足，无法进行分析。到第3个月，已有12/14例患者（86％）达到了分子CR。在包括三名未接受CART细胞的患者的意向治疗基础上，总体分子缓解率为12/17（71％）。 在那些获得CR的患者中，有6名随后复发：5名患有CD19-疾病和1名患有CD19+疾病。来自患有CD19-复发的患者的BMDNA的下一代测序表明，有4/5患者的CD19基因突变，预计会导致表面表达丧失（补充图7）。在CART细胞治疗之前无法检测到这些突变。 扩展数据图7血清细胞因子和CRP测量。在所有14例CART细胞输注后的前14d，通过细胞计数微珠阵列评估的血清IFN-γ，IL-6，IL-10和CRP（a）；y轴表示针对细胞因子的以pg/ml为单位的血清水平，对于CRP而言为mg/L。还通过在MagPix-Luminex平台上的30个细胞因子面板评估了14位患者的血清样本。b中给出了分析物的最大绝对值；线代表中值。相对于第0天（即，CART细胞前输注）的最大倍数变化在c中进行了描述，其中红色代表相对于基线值的增加，蓝色代表相对于基线值的减少。扩展数据图8 CART细胞在骨髓中的持久性。通过CART细胞输注后的转基因特异性序列，通过流式细胞术和qPCR评估了CART细胞在BM中的持久性。a，13名可评估患者的骨髓CART细胞百分比。b，13名可评估患者的骨髓中CART细胞的绝对数量。c，通过qPCR在14例可评估患者中评估了BM中CART细胞的持久性。d，用于鉴定单重，可行的CD45+CD3+淋巴细胞种群的门控策略。参考健康捐献者对照来控制CAR表达。e，两名患者（CPL-10和CPL-15）分别在输注CART细胞后2个月和7d突然丢失可检测到的CART细胞。用自体辐照的CAR+T细胞刺激每位患者的PBMC（2个月时为CPL-10，CART输注后1个月时为CPL-15）。然后在标准的4小时铬释放试验中，将培养的PBMC与51Cr标记的自体CAR+T细胞以及CART细胞以E：T的比率进行孵育。如方法中所述计算比裂解，数据为平均值±s.d。 在经过大量治疗的晚期复发/难治性ALL患者中，CATCART细胞在第28天和第12/14名患者中共导致10/13名患者发生分子CR（95％CI，46-95％）。这些95％CI的下限高于在接受化学疗法治疗的历史对照中所见的20％分子CR率。这些反应和生存率可与已发表的其他第二代CD19CAR在儿科[1,3,4,16]和成人[2,5,19]ALL中的研究结果相媲美。在中位14个月中，有5/14的患者仍处于CR/CCR中，并且持续存在CART细胞。在颅内照射/SCT后出现多个CNS复发的患者中观察到持续的反应，表明CART细胞对CNS复发有效。一年的OS和EFS（分别为63％和46％）与已发表的数据[3,20]相当，包括对tisagenlecleucel4的关键ELIANA研究，tisagenlecleucel4是一种基于FMC63的CART细胞产品，现已获准用于复发/难治性小儿ALL（81％CR；1年OS和EFS，分别为76％和50％）。在这些研究中，可变比例的患者合并了SCT，而在我们的试验中，CART细胞被设计为独立疗法，没有患者接受SCT。 令人惊讶的是，根据我们的体外和鼠类数据，CATCART细胞在患者中表现出出色的扩增能力。血液中CART细胞的平均最大浓度（,拷贝/μgDNA）高出3倍，并且在最初28d累积暴露于CART细胞，通过平均AUC评估（1,,拷贝/μgDNA），尽管这些结果是根据完整队列（包括扩展不良的无应答患者）计算得出的，但比tisagenlecleucel16,21的报告高出5倍。鉴于我们的大多数患者的肿瘤负荷较低，这与CART扩展减少有关，因此，这些结果尤其显着[2]，并且因为在大多数情况下，看到的扩展没有促进促炎细胞因子的显着升高，这表明低亲和力CART的扩展细胞可能对细胞因子的依赖性较小。CATCART细胞的中位半衰期（34d）大于tisagenlecleucel报道的半衰期（14.2d）。在最后一次随访中，有11/14例患者可通过flow/qPCR检测到CART细胞，并且CART细胞的中位持续时间为d（ELIANA研究为d）。我们的CAR包含了一个4-1BB共刺激域，与CD28相比，它可以通过防止通过强直信号的疲惫来延长持久性[8,22]，但是4-1BB的存在不足以实现此目的[3]。虽然我们的临床前数据表明抗原诱导的增殖存在内在差异，但在我们的临床研究中，我们使用了磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子，因为这可以在CD4/CD8两个子集上提供更好的CAR表达，而ELIANA研究则利用了人类延伸因子1-α（EF1α）启动子，这可能是导致观察到的差异的原因。此外，我们的生产方法在13/14例患者中未利用细胞因子，导致CART细胞具有主要是幼稚和/或中枢记忆表型，这可能有助于CART细胞的良好扩增和持久性。尽管如此，我们的临床前数据表明，CATCART细胞的增强的扩增和出色的持久性可能部分是由CATCART细胞中IL-7R和Bcl-2的更高表达介导的，从而促进体内稳态增殖并防止细胞凋亡。重要的是，CATCART细胞和替萨根细核细胞是仅有的报道的CD19CART细胞产物，可以可靠地长期维持超过2个月[1,3,19]。这对于确定是否应将CART细胞用作独立疗法或作为SCT的桥接疗法至关重要。CATCART细胞的安全性是有希望的，没有严重的CRS，但是这需要谨慎解释，因为在我们的研究中10/14患者的白血病负担很低，这与严重CRS的可能性降低相关[23]。需要对白血病负担更高的患者进行更大的研究，以证实这一发现。尽管如此，我们观察到的细胞因子概况似乎与高亲和力CAR报道的细胞因子谱不同，这表明低亲和力CAR的细胞因子分泌可能存在内在差异，这在BM微环境中比在体外环境中更加明显。正如先前在儿童中所描述的那样，神经毒性通常是轻度的并且可以自行解决。Cytopenias与tisagenlecleucel相关的可比性：6例（42.9％）的3/4级中性粒细胞减少症持续至第28天，而ELIANA研究中为53％。这些大多在2个月后自行解决，仅与2例患者的主要感染相关。晚期中性粒细胞减少症的潜在机制尚不清楚。六名反应患者复发。在这些患者中的一位以及一名无反应的患者中，复发为CD19+，并与初始扩增后CART细胞的丢失有关。如先前报道[2]，在这些患者中检测到CAR特异性细胞毒性反应，提示T细胞介导的排斥反应。治疗失败的主要原因是CD19-复发（5/14例患者），尤其是在肿瘤负荷较高的患者中。如前所述[24]，这是由于具有CD19突变的克隆的增长所致，该克隆预计会导致在细胞表面未表达的截短蛋白，这些蛋白处于来自CART细胞的选择性压力下。我们的工作表明，与Tisagenlecleucel报道的临床前研究相比，具有与FMC63CAR相似的表位，结构和稳定性的低亲和力CD19CAR表现出增强的增殖能力和抗白血病反应，并在患者中具有更大的扩展性以及出色的持久性。更广泛地说，它证明了通过改变与同源抗原的结合亲和力来调节CAR功能的潜力。识别
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