翻译全文：

血小板减少和血小板输注无效的非同种免疫机制

RogerBelizairea,RobertSMakarb,?

a马萨诸塞州波士顿，BrighamandWomen’sHospital,，成人输血医学副主任

b马萨诸塞州波士顿，MassachusettsGeneralHospital，输血处处长

摘要

血小板输注无效是输血医学专家遇到的临床常见问题。众所周知，血小板输注无效的大多数原因不是人类白细胞同种免疫、血小板特异性抗原或ABO抗原的结果，而是血小板封存和消耗的结果。这篇综述总结了导致血小板输注无效的临床因素，并着重介绍了导致该临床问题的新生物学机制的最新数据。

内容

脾肿大和脾封存

血小板消耗的新机制

血小板中的病原体识别受体信号传导

血小板与细菌相互作用

中性粒细胞胞外陷阱和组蛋白

血小板凋亡

血小板去唾液酸化

内皮活化和血管性血友病因子裂解蛋白酶ADAMTS13活性

结论

利益冲突

致谢

参考文献

血小板输注无效是指血小板输注不能使血小板计数充分增加的情况。血小板输注无效的定义取决于输注后血小板计数的时间和用于评估血小板计数增加的指标(表1)。血小板输注无效的定义之一是输注ABO血型相合的血小板后，连续两次校正计数增量小于5×/L/m2[1]。虽然对人类白细胞抗原(HLA)或血小板特异性抗原进行同种异体免疫是一种很好的了解血小板输注无效的机制，可以通过特定的产品选择策略来改善，这只在10%的血小板输注无效病例中观察到[2]。因此，大多数血小板无效不是同种免疫的结果，而是临床因素的结果[3]。事实上，在临床和同种免疫因素均为血小板无效的患者中，使用HLA选择的血小板成分并不能显著改善输注后观察到的血小板增量[4]。本综述的目的是总结与血小板输注无效相关的临床因素，并着重介绍导致这一现象的生物学机制的最新数据。

许多与患者临床状态相关的不同因素被认为是血小板输注无效的原因(表2)[5-7]。在对不同患者群进行的多因素分析中，脾肿大、造血干细胞移植、弥散性血管内凝血、发热、出血和使用抗菌药物均与血小板输注无效有关[8-12]。随后的一项减少血小板同种异体免疫的试验(TRAP)分析，纳入例接受诱导化疗的AML患者，从例血小板输注中收集数据，量化各种非免疫临床因素对输注后1、18~24h增量的影响。除了性别平等以外，独立预测这两个时间点输血后血小板计数减少的最重要因素是脾肿大，暴露于两性霉素，出血，发热和感染[12]。有趣的是，输血序列号（编译者注：病人多次输注血小板后，该次血小板的序号，以准确表示同一病人单次血小板输注效率）是一个独立的预测因子，虽然是次要的，但可以预测在1小时和18至24小时的时间点血小板计数增量减少，这种作用在早期输注时最显著，与发热、感染等因素无关。作者推测化疗引起的内皮损伤可能介导血小板黏附增加和循环丢失[12]。因此，临床研究重新确定了一系列能够影响血小板输注结果的非免疫因素。除脾肿大外，推测这些研究确定的因素直接或间接反映了导致患者血小板消耗增加的病理生理过程。

脾肿大和脾封存

脾脏通过封存作用影响输注后血小板计数。Aster等人用51Cr标记的血小板输注正常人和脾肿大患者，经表面闪烁扫描测定各器官放射性，发现脾脏是标记血小板聚集的主要器官[13-15]。血小板输注后，放射性标记的血小板在脾脏内迅速聚集，大约在10分钟内发生。随着脾脏增大，外周血中可检测到标记血小板的比例逐渐降低，脾脏中可检测到标记血小板的比例逐渐升高。据估计，在任何特定的时间，正常受试者30%的血小板聚集在脾脏内，脾肿大患者50%~90%的血小板聚集在脾脏内[15]。有趣的是，肾上腺素输注增加了有脾脏患者的循环血小板水平，而对无脾脏患者无影响。此外，在脾肿大患者中，血小板计数从基线升高的百分比几乎是正常人的两倍。因此，血小板封存是可逆的，并且可以通过应激动员血小板[15]，从而使脾肿大与输注血小板破坏的消耗过程相区别。事实上，在许多脾肿大患者中，可以观察到满意的输血后增量[9]。然而，在大量脾肿大导致输血后增量反复不足的患者中，预防性输注血小板的效果并不确定。

血小板消耗的新机制

全身炎症反应和脓毒症可能通过弥散性血管内凝血促进血小板消耗和血小板减少。然而，最近的研究强调了感染和炎症可能导致血小板减少的多种其他途径，包括通过血小板与病原体、中性粒细胞和中性粒细胞的细胞外捕获物、组蛋白和活化的内皮之间的直接相互作用。见图1。此外，新的发现提出了血小板活化可能通过凋亡和去唾液酸化导致血小板清除增加的机制

图1.血小板减少症和血小板输注无效的非同种免疫机制。

血小板与嗜中性粒细胞，微生物病原体和活化的内皮的相互作用都促进了生物过程，这些过程导致内源性产生和输血的血小板的消耗和/或受体介导的清除。

AMR，Ashwell-Morell受体。

NETs，中性粒细胞细胞外陷阱。

PAMP，病原体相关分子模式。

血小板中病原体识别受体信号

近二十年来的一系列研究表明血小板表达病原体识别受体(pathogenrecognitionreceptors，PRRs)，包括Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)和NOD样受体。在发现PRRs之前，Davis等观察到静脉注射来自大肠杆菌的纯化脂多糖(LPS)与快速血小板活化和严重的血小板减少有关[16]。最近，几个独立的研究小组表明，LPS介导的细胞内信号转导所需的受体TLR4在人和小鼠的血小板上都表达[17-19]。在小鼠模型中，TLR4的血小板表达与多种LPS诱导的血小板表型有关，包括血小板减少症，与纤维蛋白原的粘附，P选择素表达以及凝血酶或胶原蛋白诱导的聚集增强[17，18，20]。除TLR4外，据报道血小板也表达TLR2[18,19,21,22]，TLR7[23]，TLR9[24,25]和NOD2[26]，提示血小板还可能对多种病原体相关分子模式产生应答。细菌细胞壁模拟物Pam3CSK4刺激了血小板聚集，该聚集因TLR2基因缺失或TLR2阻断抗体而显著降低[22]。在用鸟苷类似物洛索立宾治疗或感染了脑心肌炎病毒的小鼠中出现的血小板减少症需要TLR7[23]。Thon等人报道，暴露于未甲基化的CpGDNA的血小板显示聚集和P-选择素表达增加，而在没有TLR9的情况下，P-选择素表达减少[25]。最后，在胶原蛋白或凝血酶刺激后，NOD2对于由戊二酰二肽介导的血小板凝集增强和ATP释放至关重要[26]。

尽管有这些数据，PRR信号在血小板活化中的作用仍然存在争议。有几个研究未观察到TLR2、TLR4或TLR9激动剂治疗后血小板聚集或P-选择素表达有明显变化[19，27-31]。此外，在肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌败血症小鼠模型中，敲除血小板特异性MyD88信号通路蛋白（大多数TLR下游信号传导所必需）对血小板计数和P-选择素表达的影响较小，提示血小板TLR信号通路在全身性细菌感染中血小板活化和血小板减少中的作用有限[30，32]。TLRs的参与是否通过“非经典”机制调节血小板生物学[28]，仍是一个悬而未决的问题，值得进一步研究。然而，多项研究表明，LPS与TLR4结合以TLR依赖的方式改变血小板功能，包括线粒体功能[2]、纤维蛋白原结合[1]、中性粒细胞结合[17，27]、细胞因子分泌[29]等。

血小板与细菌相互作用

除了通过PRRs识别细菌分子外，血小板与整个细菌病原体的结合也被广泛描述[33]。血小板与细菌的相互作用可以通过多种机制促进血小板活化和凝集，包括间接结合血浆蛋白，然后血浆蛋白与血小板受体结合或直接细菌蛋白与血小板受体结合。例如，金黄色葡萄球菌ClfA和FnbpA/B蛋白均与纤维连接蛋白和纤维蛋白原结合，促进血小板上GPIIb/IIIa受体的相互作用[34]；另一种金黄色葡萄球菌表面蛋白IsdB通过直接与糖蛋白(GP)IIb/IIIa结合，促进血小板与细菌的相互作用[35]。

许多其他与葡萄球菌和链球菌蛋白有关的血小板-细菌相互作用被证实在感染性心内膜炎和其他病理状态中起重要作用[36]。细菌与GPIIb/IIIa和GPIbα受体相互作用导致的血小板活化很可能促进脓毒症时血小板聚集和消耗。有趣的是，幽门螺杆菌与血管性血友病因子(vonWillebrandfactor，vWF)结合，促进GPIbα介导与血小板相互作用[37]，导致一部分患者的血小板活化、聚集和血小板减少。值得注意的是，有效地治疗幽门螺杆菌感染的抗生素治疗也使血小板计数正常化[38-41]，提示血小板-细菌的相互作用足以引起血小板减少[42]。

中性粒细胞胞外陷阱和组蛋白

中性粒细胞在感染时释放中性粒细胞胞外陷阱(NETs)，由DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成[43]。NET释放是中性粒细胞捕杀细菌的宿主防御机制，但过多的NET形成或过低的NET清除与自身免疫、血栓形成、缺血再灌注损伤、癌症进展等众多病理过程有关[44-46]。血小板似乎有利于NET的形成并结合NET。小鼠注射LPS可通过中性粒细胞和血小板TLR4共同作用的机制引起血小板减少和肺封存血小板[17]。随后发现LPS可结合血小板TLR4，导致血小板活化并与中性粒细胞结合。活化血小板与中性粒细胞相互作用导致中性粒细胞活化、脱颗粒和NET形成。来自严重脓毒症的血小板减少症患者的血浆还通过依赖TLR4的血小板-中性粒细胞相互作用刺激了NET的释放[27]。血小板可以通过血小板P-选择素和嗜中性粒细胞PSGL-1之间的信号传导来刺激NET释放[47]。血小板可以直接与NET内的组蛋白/DNA复合物结合，也可以通过修饰NET的血浆蛋白结合[46]。体外NET结合可导致血小板黏附、活化和聚集[48]。组蛋白H3和H4能够直接与血小板TLR2和TLR4结合以介导血小板聚集[48,49]；血小板聚集既需要组蛋白诱导的钙信号来激活GPIIb/IIIa，也需要组蛋白包被的血小板的纤维蛋白原交联[49]。这些发现的病理生理相关性是由小鼠模型提示的，其中NETs促进深静脉血栓形成[50,51]，而组蛋白输注在体内引起严重的血小板减少症[49]。

除NETs外，细胞损伤和死亡是循环DNA和组蛋白的其他来源。脓毒症[52-54]或外伤[55]的患者可能会观察到高水平的循环组蛋白，可能会导致终末器官损伤[52,54,55]。在小鼠模型中，输注亚致死剂量的纯化组蛋白导致肺泡微血管内中性粒细胞和富血小板血栓聚集，内皮和上皮细胞空泡化，肺泡内出血伴纤维蛋白和富血小板微血栓聚集，肺泡间隔内纤维蛋白和胶原沉积[52]。通过观察发现，在重症患者中检测到的高血浆组蛋白水平与随后发展为中度至重度血小板减少症有关，这表明在临床环境中血液循环组蛋白与血小板减少症之间的关系[56]。

血小板凋亡

细胞凋亡包括一系列有序的生化和形态学改变，最终导致细胞死亡[57]，虽然核固缩是细胞凋亡的最初特征之一[58]，但目前已经证实缺乏细胞核的血小板可以发生凋亡[59]。此外，有几项证据表明细胞凋亡在决定血小板寿命方面具有重要作用。在这种情况下，临床因素(如药物、炎症、感染)可能通过加速凋亡而影响内源性血小板和输入血小板的寿命。

Oltersdorf等报道了用ABT-治疗的小鼠血小板计数减少，ABT-是靶向抗凋亡蛋白BCL2，BCL2L1（又名BCL-xL）和BCL2L2（又名BCL-w）的小分子拮抗剂[60]；同样，接受口服生物利用度提高的相关化合物ABT-的淋巴恶性肿瘤患者也出现了剂量限制性血小板减少症[61,62]。可以预测ABT-和ABT-也将影响输注的血小板，尽管目前尚无有关使用这两种药物中任一种治疗的小鼠或人体输注后血小板寿命的公开数据。

Mason等人在小鼠中使用全基因组筛选方法，将Bcl2l1鉴定为血小板寿命的关键决定因素[63]。此外，体外分析表明人和小鼠血小板均表达BCL2，BCL2L1和BCL2L2，这表明抑制抗凋亡途径可促进血小板死亡并从循环中清除[64-66]。单独的基因消融或BCL2L1的靶向抑制足以重现ABT-观察到的血小板减少表型，表明BCL2L1的活性对于预防血小板凋亡至关重要[64,67,68]。有趣的是，暴露于大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的人血小板显示出快速的BCL2L1降解，线粒体去极化和细胞质凝集，表明细菌或细菌产物具有诱导血小板凋亡的能力[69]；内源性血小板和输注的血小板都可能受到这种促凋亡机制的影响。

抑制蛋白激酶A（PKA）可能会促进血小板凋亡。一个仅在巨核细胞系中敲除PKA的鼠模型显示，纯合缺失小鼠的血小板寿命显着缩短，小鼠本身具有血小板减少性。有趣的是，在患有免疫性血小板减少性紫癜（ITP），糖尿病和败血症的血小板减少性患者的血小板中观察到凋亡，并且伴随着明显降低的PKA活性。在ITP或糖尿病患者的血浆中孵育后，正常血小板中检测到PKA活性降低和细胞凋亡[70]。针对糖蛋白Ibα(GPIbα)的抗体可以在体外诱导血小板凋亡，这种凋亡可以通过基因或化学抑制AKT（在PKA上游起作用的丝氨酸/苏氨酸激酶）来阻止[71]。因此，体液因子可能会激活血小板中的凋亡途径，从而缩短其寿命并导致血小板减少。

缺乏促凋亡蛋白的小鼠的检测也支持凋亡在调节血小板寿命方面的作用。通过线粒体通透性驱动细胞凋亡的Bak和Bax联合丢失与血小板数量增加和循环存活率显著有关[72]。此外，在Bak/Bax双敲除小鼠中，BCL2L1缺失或ABT-抑制的血小板减少症被完全拯救，表明促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡是决定血小板寿命的关键[63，64，72]。有趣的是，缺乏BAK和BAX上游激活剂的小鼠血小板数量和存活受影响较小，包括BAD、BBC3(又称PUMA)、BID和BIM[64，73，74]；在这些小鼠中缺乏稳健的血小板表型可能反映了这些蛋白质之间的功能冗余或存在新的BAK/BAX激活途径。

血小板也会发生与凋亡相一致的表型变化，包括线粒体去极化、细胞色素c释放、胞膜空泡化和磷脂酰丝氨酸(PS)暴露[63，66，75]。在有核细胞中，暴露的PS可被多种受体和特定的蛋白质识别，并作为典型的“吞噬”信号通过吞噬作用促进细胞清除[76]。值得注意的是，血小板上PS暴露发生在生理激动剂激活后，并通过促进肌腱蛋白和凝血酶原酶复合物的组装而促进血小板的促凝功能[77，78]。PS暴露在血小板清除中的确切作用尚不确定，尽管有来自急性心肌梗死、菌血症、登革热和原发性血小板增多症患者的证据表明PS暴露增加与中性粒细胞、巨噬细胞和内皮细胞吞噬血小板有关[79-82]。抗GPIbα抗体激活Akt导致PS暴露于血小板上并被肝脏巨噬细胞吞噬，反之，抑制Akt信号或阻止PS暴露可使血小板免于吞噬[71]。有趣的是，活化和凋亡导致的血小板PS暴露似乎是通过不同的分子机制发生的[75，83]，危重症患者血小板减少和血小板输注无效是否与其中一种或两种机制有关尚待确定。

血小板去唾液酸化

修饰血小板糖蛋白的O-和N-连接的聚糖，特别是GPIbα，终止于唾液酸残基[84]。唾液酸的去除或去唾液酸化暴露了唾液酸与之相连的β-半乳糖部分。血小板表面暴露的β-半乳糖可导致其与肝细胞和Kupffer细胞上的AshwellMorrell受体（AMR，也称为去唾液酸糖蛋白受体）结合并从血液中清除[85-87]。去唾液酸化随着血小板的老化而发生，并且可能是去除衰老的血小板的一种机制[86,88]。在肺炎链球菌脓毒症的小鼠模型中，明显的血小板减少不是由弥散性血管内凝血引起的，而是由细菌NanA神经酰胺酶引起的血小板去唾液酸化的结果，从而导致AMR清除血小板[89,90]。同样，Jansen等人最近报道，流感病毒与血小板唾液聚糖的结合与病毒神经酰胺酶引起的血小板去唾液酸化有关[91]，这为在流感感染患者中观察到的血小板减少症提供了可能的机理解释[92]。

有趣的是，血小板活化也导致去唾液酸化。抗GPIbα抗体激活小鼠血小板后，内源性血小板溶酶体神经氨酸酶易位和表面表达，导致血小板去唾液酸化。去唾液酸化导致血小板清除和血小板减少是一个依赖于AMR的Fc受体(FcR)独立性机制[93]。在免疫性血小板减少性紫癜患者中，检测GPIbα的自身抗体可预测对FcR阻滞的疗法(即类固醇和静脉注射免疫球蛋白)的无效，提示血小板活化、去唾液酸化和AMR介导的血小板清除可能是这些患者血小板减少的关键驱动因素[94,95]。在此背景下，在SARSCoV2感染中观察到的血小板活化增加可能是重症COVID-19患者出现血小板减少和血栓栓塞并发症的原因[96-98]，尽管COVID-19患者的血小板唾液酸化尚待检查。在剪切应力下可溶性vWF与血小板GPIbα的结合也导致血小板信号传导、活化、去唾液酸化和清除。血小板活化的机制可能是当与vWF结合时剪切应力诱导的GPIb?的机械感觉域的展开，导致血小板信号传导和激活[99]。这种机制可以解释为什么vWF与血小板的结合增加（如2B型vonWillebrand病）或使用瑞斯托菌素后导致血小板减少[84]。有趣的是，与血小板结合的vWF显著升高导致的血小板去唾液酸化被认为介导了急性登革热感染患者观察到的血小板减少[]。

最近的一项前瞻性研究支持了去唾液酸化作为危重患者血小板减少机制的临床意义[]。符合脓毒症、严重脓毒症、脓毒症休克临床定义的患者依据血小板计数低于×/L的血小板减少而分级。比较了有血小板减少症和无血小板减少症的脓毒症患者的血小板去唾液酸化程度，发现血小板减少症患者的血小板去唾液酸化程度明显更高。符合严重脓毒症临床标准且血小板计数≤50×/L的患者被进一步纳入一项临床试验，在该临床试验中，他们被随机分配接受标准抗生素治疗与抗生素联合神经氨酸酶抑制剂奥司他韦（具有治疗和预防流感的临床效用）治疗。与接受常规治疗的患者相比，较大比例的奥司他韦治疗的患者在试验期间血小板计数增加到至少×/L。此外，奥司他韦组的患者血小板减少症持续时间较短，血小板输注较少。尽管如此，奥司他韦治疗对28天死亡率没有影响[]。

内皮活化和ADAMTS13活性

在健康的稳态条件下，与内皮细胞的血小板相互作用受到内皮糖萼的限制，它起到静电排斥作用和掩盖了血小板粘附受体的双重作用[]。内皮一氧化氮，前列环素和CD39胞外ATP酶活性还通过抑制血小板和内皮细胞上粘附受体的表面表达来调节血小板与内皮的相互作用[]。阻止血小板粘附的内皮受损机制发生在许多病理状态，包括缺血[]，慢性肾脏病[]，高血糖[]，血脂异常[]，创伤[]，炎症[]，和败血症[]；也有人认为血小板-内皮的相互作用可以引发动脉粥样硬化病变的发展[,]。这些病理状态通常与导致内皮细胞活化的炎性细胞因子产生有关[-]，其以暴露在内皮管腔表面上的E-选择素，P-选择素和vWF为特征[]。内皮细胞P-选择素与血小板上的P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）或GPIbα结合，以支持血小板沿内皮细胞滚动[-]；血小板GPIbα与内皮vWF的结合也可以使血小板滚动[,]。在炎症和血小板活化状态，纤维蛋白原可通过内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1)或αVβ3桥联血小板整合素αIIbβ3，促进血小板与内皮表面的牢固黏附[]。最后，活化的血小板可以促进内皮细胞的活化[,]，表明血小板具有启动和维持血小板-内皮相互作用的能力。

血小板-内皮细胞相互作用增强可能直接导致危重症患者血小板减少。Gawaz等观察到正常供者血小板经脓毒症患者血浆处理后，与健康人血浆相比，体外血小板-内皮相互作用明显增强[]。ADAMTS13（一种具有I型血小板反应蛋白的重复整合素样金属蛋白酶，具有13种活性）是由内皮相互作用释放血小板的vWF裂解所必需的，在危重症、血小板减少的成人和儿童中有明显的比例降低[]。值得注意的是，这些患者与血栓性血小板减少性紫癜（TTP）患者不同：他们通常具有更高的血小板计数和可测量的ADAMTS13活性（正常值的11-40％）；他们不携带直接抑制ADAMTS13功能的自身抗体，这些自身抗体是TTP的特征性病理改变，而且他们不对血浆置换反应[-]。不足为奇的是，在脓毒症伴有消耗性凝血病的病例中发现了与危重病和血小板减少症相关的ADAMTS13缺乏症[,-]；非感染性全身性炎症的血小板减少症患者的ADAMTS13活性也低于正常水平，尽管这些患者与脓毒血症患者相比通常水平更高[,]。

结论

引起血小板消耗增加的脾封存和疾病进程可能导致血小板输注无效。多种机制可能解释了为什么在感染和炎症的情况下可重复观察到血小板减少和血小板输注无效。理解这些病理生理过程可能会在将来引导新型的治疗疗法，例如在脓毒血症患者中使用神经氨酸酶抑制剂[]。然而，本综述的读者最可能面临的困境是，对于出血严重、血小板输注无效的血小板减少患者，现在该如何提供。关于这个问题，几乎没有临床指导。在排除抗体介导的清除作用导致血小板输注无效后，目前还没有可供选择的产品策略来抑制循环中显著降低血小板寿命的其他机制。尝试超过定义的血小板计数阈值，这本身就是业界确定的，并反复输注血小板作为治疗出血的治疗手段，可能会增加患者的血容量，并导致局部，区域和国家血小板短缺。治疗决策应以仔细评估病人和病人出血的性质为指导。在可能的情况下，应通过局部措施来解决局部出血问题，如为流鼻血包扎，而不是输注血小板。

另外，应考虑使用抗纤溶剂，例如ε-氨基己酸或氨甲环酸[7,]；多个临床病例系列提示血小板减少症患者出血改善[-]。在不同的临床环境中使用氨甲环酸的随机对照试验证明了安全性，并且观察到血栓形成的风险不至于极小[-]。目前在一项双盲随机对照试验TREATT试验中研究在接受化疗或干细胞移植的血液系统恶性肿瘤患者中预防性使用氨甲环酸[]。总之，由于与严重疾病相关的临床因素而导致的血小板输注无效通常是无法避免和无法调节的，这代表着治疗上的重大挑战和机遇。与输血医学的许多领域一样，在这种情况下需要精心设计的临床研究来指导治疗决策。

审核：输血小医生

来源：麻醉MedicalGroup，文章仅作分享，如有侵权请联系我们。

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